Immuno ovaires
(protocole d'Emilie)

- Dissections des ovaires dans du PBT 0,1% tween et les placer dans une coupelle de PBT sur glace (pas plus que vingt trente min) (et sous papier alu si GFP endogene)

    Penser a sortir un aliquot de PFA 20% (aliquots de 200 µl)

- Transferer les ovaires dans le PBT avec un cone (p1000) coupé dans un eppendorf 1,5ml, oter le PBT et remplacer par la solution de fixation (200 µl PFA 20%, 800µl de PBT 0,1% tween et 1µl de tritonX100)

- Fixer les tissus sur roue 20 minutes a RT  ds le noir

- Rincer 3 fois 10 minutes au PBT 0,1% a RT ds le noir

- Soit on deshydrate (a 4°C, 30, 50, 80 et 100% etOH 10 min…>-20°C), ds ces cas la on ne met pas ds le noir car la GFP endogene ne tientpas la deshyd de tte facon


Soit on bloque 30 minutes ds le solution de blocage a 4°C ds le noir

- Incuber ON 4°C ds le noir avec Ac Iaire 1/200 eme (dib, sad, a 4°C il y a 1 aliquot en crs utilisation, s’il n y en a plus, ils sont a -20°C, boite jaune, voir avec JP) dans 100 µl de blocage (0,5 µl d anticorps/100µl blocage)
 (si marquage GFP, mettre Ac antiGFP au 1/200eme a  4°C)

Ne pas reutiliser les Ac pr les ovaires

- Rincer 5 fois 15 minutes 4°C dans PBT 0,1% ds le noir

-  Incuber 2 heures RT (salle de culture) avec l’Ac IIaire (alexa 568=red au 1/1000eme, si marquage GFP Ac alexa 488 au 1/1000 , Ac sont a -20°C)

- Rincer 3 fois 15 minutes dans du PBT 0,1% tween a 4°C

- Changer le PBT une 4eme fois et monter (dilacerer avec minuties et enlever les œufs) ds citifluor (4°C) entre lame et lamelle. Conserver les lames a l obscurité à -20°C.


PBT 0,1% tween : 5 ml PBS 10X, 45 ml H20 milliQ, 50 µl tween 20

PFA 20% 2g de PFA (4°C), qsp 10 ml PBS 1X, dissoudre a 80°C, aliquoter par 200 µl et conserver a -20°C, le PFA est stable un mois a -20°C, ne pas le recongeler apres premiere decongelation)

Solution fixation : 200 µl PFA 20%, 800µl de PBT 0,1% tween et 1µl de tritonX100

Solution de blocage : 1,9 ml PBT 0,1% tween, 100 µl serum (-20°C), et 0,04g de BSA)