Marquage in situ et anticorps sur embryons de drosophile

Fixation
 déchorionnation 2-3min les embryons à l’eau de Javel 25%
 lavage eau du robinet
 fixation 20min formaldéhyde 4% + heptane
 dévitellinisation au méthanol
 3 lavages méthanol
 conservation dans le méthanol à –20°C


Marquage in situ
 réhydratation 2min 50% méthanol + PBT* (PBT* = PBS, O,1% Tween 20, eau DEPC)
 2 lavages 2min PBT*
 fixation 15min formaldéhyde 4% (200uL FA+ 1600uL PBT)
 1 lavage rapide PBT (PBS, O,1% Tween 20, eau monodistillée)
 5 lavages 5min sur roue PBT*
 5 min 50% PBT* + HYB

solution HYB : (3mL / tube)
         5mL         7,5mL    10mL        formamide désionisée
        2,5mL     3,75mL    5mL        SSC 20x eau DEPC
        2,4mL     3,6mL    4,8mL    Tris HCl pH=6,8
        100uL     150uL    200uL    Tween 10%
        10uL        15uL        20uL         héparine
        20uL     30uL        40uL         ARNt
total:10mL     15mL        20mL

 5min HYB
 1h HYB à 55°C
 ON à 55°C avec la sonde (1uL dans 300uL) _ dénaturer à 80°C éventuellement lors de la première utilisation

 1 lavage 20min HYB à 55°C            
 (préincuber l’anticorps anti-DIG-HRP au 1/500e avec des embryons réhydratés 1h à RT)
 1 lavage 20min 50% HYB + PBT à 55°C
 4 lavages 20min PBT à 55°C, le dernier est mis sur roue à RT
 incubation 2h anticorps anti-DIG-HRP (Roche) au 1/500e ou anti-DIG-AP (Roche) au 1/2000e
 3 lavages 10min PBT
 réaction HRP 10min avec TSA-FITC (NEN, 4uL dans 200uL tampon d’amplification)
 1 lavage rapide PBT
 3 lavages 10min PBT
 traitement H2O2 0,3% 30 min sur roue
 1 lavage rapide PBT
 5 lavages 5min PBT
 incubation ON anticorps anti-Cut (DSHB) au 1/1000e, anti-Bgal (Cappel) au 1/2000e, anti-pros (Jan) au 1/1000e


Marquage anticorps
 3 lavages 20min PBT
 incubation 1h anti-souris-biotine (Jackson) au 1/1000e, anti-lapin-biotine (Jackson) au 1/1000e, anti-lapin-Cy5 (Jackson) au 1/500e
 3 lavages 20min PBT
 (préparer, 30 min avant, la solution streptavidine-HRP : solution A + solution B au 1/100e dans du PBT)
 incubation 1h streptavidine-HRP (kit ABC Vectastain)
 3 lavages 10 min PBT
 réaction HRP 10min avec TSA-biotine (NEN, 4uL dans 200uL tampon d’amplification)
 1 lavage rapide PBT
 3 lavages 10min PBT
 incubation 30min streptavidine-Alexa568 (Molecular Probes) au 1/1000e
 3 lavages 10 min PBT
 passage en 50% PBT + glycérol
 dépot des embryons sur lame dans le milieu de montage